Determinación de espectinomicina por cromatografía líquida de alto rendimiento Wayeal con detector ELSD

El Detector de Dispersión de Luz por Evaporación (ELSD) es un nuevo detector de masa con aplicabilidad teórica a cualquier compuesto que pueda formar partículas gaseosas. La edición de 2025 de la Farmacopea especifica el uso de la Detección por Dispersión de Luz por Evaporación (ELSD) para el análisis y control de calidad de más de 100 variedades de fármacos. En la práctica, el ELSD se aplica con mayor frecuencia a compuestos que carecen de absorción ultravioleta (UV), como el astragalósido, los carbohidratos, los aminoglucósidos y el colesterol, a menudo sirviendo como un método de detección complementario a los detectores UV y de fluorescencia. Sin embargo, los resultados del ELSD se ven influenciados por múltiples factores, incluyendo la composición de la fase móvil, la concentración de disolvente orgánico, el modo de elución y las condiciones de nebulización. Por lo tanto, para asegurar resultados analíticos precisos y consistentes, es esencial evaluar el impacto de estos factores en los resultados.
Este estudio, que hace referencia al método analítico para el hidrocloruro de espectinomicina de la Parte II de la Farmacopea de 2025 y guiado por los principios ICH QbD, empleó un diseño experimental ortogonal para seleccionar y optimizar las condiciones analíticas.

Fig 1 Hidrocloruro de Espectinomicina

2. Instrumento y Método

En este estudio, el análisis cromatográfico se llevó a cabo utilizando el sistema HPLC serie LC3200 de Wayeal. La configuración del instrumento incluía una bomba de gradiente cuaternario, un automuestreador, un compartimento de columna y un Detector de Dispersión de Luz por Evaporación. El control del sistema y la adquisición/procesamiento de datos se realizaron con el software de cromatografía SmartLab 2.0.

Tabla 1 Condiciones de HPLC

3. Preparación de la solución

Solución de muestra: La solución madre de hidrocloruro de espectinomicina fue proporcionada por el cliente con una concentración etiquetada de 10 mg/mL y una pureza del 99.8%.

Solución acuosa de ácido trifluoroacético 0.1M:Pipetear con precisión 6.8 mL de ácido trifluoroacético en un matraz aforado de 1000 mL. Diluir hasta la marca con agua purificada y mezclar bien. Finalmente, filtrar al vacío la solución a través de un filtro de membrana de celulosa de 0.45μm antes de usar.

Soluciones estándar: La solución madre se diluyó con agua purificada para preparar soluciones de muestra con concentraciones de 0.15, 0.25, 0.35, 0.50 y 0.70 mg/mL, respectivamente. Cada solución se filtró luego a través de un filtro de membrana de celulosa de 0.45μm antes de usar.

4. Resultados y Discusión

La Farmacopea China emplea las mismas condiciones cromatográficas para analizar las sustancias relacionadas y el contenido del componente principal bajo la entrada de hidrocloruro de espectinomicina. El método establece que "el detector se puede configurar en función de las circunstancias reales". Durante el estudio, considerando las características instrumentales del ELSD3260, los requisitos del método analítico y la literatura relevante, se empleó un diseño experimental de Plackett-Burman para seleccionar múltiples parámetros experimentales (Tablas 2 y 3). Posteriormente, se utilizó un diseño de Box-Behnken (Tabla 4) para optimizar la respuesta del área del pico del detector ELSD.

Tabla 2 Diseño Experimental de Plackett-Burman

Tabla 3 Análisis ANOVA de los Resultados Experimentales de Plackett-Burman

Como se puede ver en la Tabla 3, el caudal de gas, el caudal de la fase móvil y la compensación post-columna mostraron efectos negativos. Específicamente, reducir el caudal de gas y el caudal de la fase móvil, junto con la desactivación de la compensación post-columna, podría aumentar la respuesta del pico cromatográfico. Sin embargo, disminuir el caudal de la fase móvil puede conducir a un ensanchamiento del pico y una reducción de la sensibilidad de detección. Por lo tanto, el caudal se mantuvo consistente con el método estándar. Si bien la temperatura de la columna y la temperatura de detección exhibieron efectos positivos, no mejoraron significativamente el valor de la respuesta. En consecuencia, los estudios posteriores se centrarán en la optimización del caudal de gas, la temperatura del nebulizador y la temperatura del evaporador.

Los efectos del caudal de gas, la temperatura del nebulizador y la temperatura del evaporador en el valor de la respuesta se investigaron empleando un diseño experimental de Box-Behnken dentro de un marco de metodología de superficie de respuesta. El diseño experimental se presenta en la Tabla 4.

Tabla 4 Diseño Experimental de Box-Behnken

Las condiciones de detección para el hidrocloruro de espectinomicina se determinaron simulando la variación del área del pico utilizando la metodología de superficie de respuesta (Figura 2) y considerando los rangos de parámetros instrumentales: temperatura del nebulizador 85°C, temperatura del evaporador 80°C, temperatura del detector 50°C y caudal de gas 0.2 SLM.

A. Efecto del caudal de gas y la temperatura del evaporador en el área del pico

B. Efecto del caudal de gas y la temperatura del nebulizador en el área del pico

C. Efecto de la temperatura del nebulizador y la temperatura del evaporador en el área del pico

Fig 2 Variación del área del pico

Precisión de la inyección

La solución madre de hidrocloruro de espectinomicina se diluyó a 0.35 mg/mL, y se realizaron seis inyecciones consecutivas bajo las condiciones cromatográficas especificadas con los cromatogramas registrados. Se calcularon las desviaciones estándar relativas (RSD%) del tiempo de retención y el área del pico para el pico cromatográfico de hidrocloruro de espectinomicina. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Resultados de la prueba de precisión de la inyección

Especificidad

De acuerdo con la guía ICH Q2(R2) sobre la validación del procedimiento analítico y el Capítulo General de la Farmacopea China 〈9101〉 Guías sobre la Validación del Método Analítico, el método optimizado se validó para la especificidad, el rango lineal, la exactitud y la repetibilidad.

Se analizaron en paralelo agua purificada y la solución de muestra (0.35 mg/mL) con los cromatogramas registrados. Los resultados (Figura 3) no mostraron ningún pico cromatográfico en el tiempo de retención del hidrocloruro de espectinomicina en el cromatograma de agua purificada, mientras que el pico de hidrocloruro de espectinomicina en la solución de muestra logró la separación de la línea base de los picos adyacentes (R > 1.5).

Fig 3 Resultados analíticos de la muestra de hidrocloruro de espectinomicina (0.35 mg/mL)

Rango lineal

Prepare tres muestras paralelas de solución madre de hidrocloruro de espectinomicina de acuerdo con el método de preparación de la solución estándar, analícelas bajo condiciones cromatográficas y registre los cromatogramas. Realice un análisis de regresión utilizando las áreas de los picos cromatográficos y las concentraciones correspondientes.

Fig 4 Resultados de la prueba de linealidad (Transformados logarítmicamente vs. No transformados)

De acuerdo con la literatura, la relación entre el valor de respuesta del ELSD y la concentración es no lineal, lo que requiere la transformación logarítmica tanto del valor de respuesta como de la concentración antes de realizar el análisis de regresión [8,9,10]. Después de aplicar la transformación logarítmica a los datos experimentales, el coeficiente de correlación de la curva de regresión lineal superó 0.999, lo que es significativamente mejor que el resultado obtenido sin la transformación logarítmica (como se muestra en la Figura 4).

Exactitud y repetibilidad

La solución madre de hidrocloruro de espectinomicina se diluyó a concentraciones de 0.25, 0.35 y 0.50 mg/mL. Para cada concentración, se prepararon tres muestras paralelas, se analizaron bajo las condiciones cromatográficas especificadas y se registraron los cromatogramas. El contenido se calculó utilizando la curva de regresión, y se evaluaron la recuperación y la repetibilidad. Los resultados se presentan en la Tabla 6.

Tabla 6 Resultados de la prueba de recuperación

Límite de cuantificación (LOQ)

Diluir la solución madre de hidrocloruro de estreptomicina a una concentración de 12μg/mL. Analizar la muestra bajo condiciones cromatográficas y registrar el cromatograma. Calcular la relación señal-ruido (S/N) del pico cromatográfico de hidrocloruro de estreptomicina y determinar su repetibilidad. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7 Resultado de la prueba LOQ

Los resultados indican que, bajo el requisito de la guía ICH de S/N > 10, la desviación estándar relativa del área del pico para esta concentración de solución de hidrocloruro de espectinomicina cumple con los criterios. Por lo tanto, puede servir como el estándar de límite cuantitativo para el hidrocloruro de espectinomicina.

5. Conclusión

Basado en el método farmacopeico, este estudio estableció un procedimiento analítico confiable y robusto para la cuantificación del hidrocloruro de espectinomicina. Las condiciones del detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD) se optimizaron sistemáticamente. El método optimizado demostró una estabilidad y exactitud mejoradas, una mayor sensibilidad de detección y un rango lineal satisfactorio.

El detector ELSD3260 es un detector de flujo dividido y baja temperatura de nuevo diseño y desarrollo. Es adecuado para el análisis de sustancias no volátiles y semivolátiles, proporcionando una valiosa alternativa para compuestos que carecen de absorción UV. En este estudio, el uso del ELSD3260 para el análisis del hidrocloruro de espectinomicina resultó en excelentes valores de respuesta y reproducibilidad, junto con una mayor sensibilidad de detección. Estos hallazgos demuestran que este instrumento es adecuado para el análisis cuantitativo del hidrocloruro de espectinomicina.