Determinación del Análogo de Hidroxi Metionina en Piensos por Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento de Wayeal

El análogo hidroxilado de metionina (MHA) es un aditivo de ácido orgánico ampliamente utilizado en la industria de piensos como sustituto de la metionina. El MHA se utiliza ampliamente en el pienso de aves de corral (pollos de engorde y ponedoras), cerdos (lechones y cerdos de engorde), rumiantes (vacas lecheras y vacas de carne) y acuicultura (peces y camarones). Como sustituto de la metionina, demuestra efectos significativos en la reducción de los costos de los piensos, la mejora del entorno intestinal de los animales y el fortalecimiento de la inmunidad animal.

La cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detección UV es muy adecuada para el análisis de diversas muestras complejas de piensos, debido a su excelente eficiencia de separación, fuerte resistencia a la interferencia de la matriz, alta sensibilidad de detección y resultados cuantitativos estables y fiables. Este experimento se llevó a cabo de acuerdo con la norma "Determinación del análogo hidroxilado de metionina en piensos por cromatografía líquida de alta resolución" (GB/T 19371-2025). Se empleó un cromatógrafo líquido de alta resolución de la serie Wayeal LC3400 equipado con un detector UV para validar el procedimiento de pretratamiento de muestras y el sistema de separación y detección cromatográfica líquida, permitiendo tanto la detección cualitativa como el análisis cuantitativo preciso del análogo hidroxilado de metionina en diversos tipos de muestras de piensos.

Palabras clave: pienso; análogo hidroxilado de metionina; cromatografía líquida de alta resolución.

1. Instrumentos y reactivos

1.1 Lista de configuración de HPLC

Tabla 1 Lista de configuración del sistema de cromatografía líquida de alta resolución

1.2 Lista de reactivos y estándares de referencia

Tabla 2 Lista de reactivos y estándares de referencia

1.3 Condiciones de cromatografía líquida

Tabla 3 Condiciones de cromatografía líquida de alta resolución

1.4 Materiales experimentales y equipo auxiliar

Limpiador ultrasónico;

Mezclador Vortex;

Centrífuga de alta velocidad;

Balanza analítica;

Agitador.

2. Método experimental

2.1 Preparación de soluciones

2.1.1 Soluciones de curva estándar:

Pesar con precisión una cantidad apropiada de estándar de referencia de análogo hidroxilado de metionina y disolverlo en un 10% de acetonitrilo para preparar una serie de soluciones estándar a concentraciones másicas de 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 40.0 y 80.0μg/mL. Transferir con precisión 5 mL de cada solución estándar a tubos de ensayo tapados de 15 mL por separado. Añadir con precisión 0.1 mL de solución de hidróxido de potasio al 50% y agitar en vortex durante 15 segundos. Luego, añadir con precisión 0.2 mL de solución de ácido fosfórico al 50% y agitar en vortex durante otros 15 segundos. Centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de membrana microporosa antes del análisis.

2.1.2 Soluciones de muestra de prueba:

Pesar 5 g de muestra de pienso en un recipiente, añadir 50 mL de solución de acetonitrilo al 10% y mezclar durante 30 segundos. Colocar en un agitador y agitar durante 30 minutos. Centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos y reservar el sobrenadante para su uso posterior. Transferir con precisión 5 mL del sobrenadante anterior a un tubo de ensayo tapado de 15 mL. Añadir con precisión 0.1 mL de solución de hidróxido de potasio al 50% y agitar en vortex durante 15 segundos. Luego, añadir con precisión 0.2 mL de solución de ácido fosfórico al 50% y agitar en vortex durante otros 15 segundos. Centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de membrana microporosa antes del análisis. Preparar dos soluciones de muestra de prueba paralelas.

2.1.3 Soluciones de prueba de recuperación:

Transferir con precisión 2.5 mL del sobrenadante de la muestra y 2.5 mL de cada solución de la serie estándar a un tubo de ensayo tapado de 15 mL. Añadir con precisión 0.1 mL de solución de hidróxido de potasio al 50% y agitar en vortex durante 15 segundos. Luego, añadir con precisión 0.2 mL de solución de ácido fosfórico al 50% y agitar en vortex durante otros 15 segundos. Centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de membrana microporosa antes del análisis.

3. Resultado del experimento

3.1 Linealidad y rango

Tabla 4 Tabla de concentración de curva estándar

Fig 1 Curva estándar de análogo hidroxilado de metionina

Nota: Se tomaron cantidades apropiadas de la solución estándar de referencia de análogo hidroxilado de metionina y se diluyeron en serie a una serie de concentraciones para la preparación de la curva estándar. El rango lineal fue de 0.5–80.0 μg/mL, y el coeficiente de correlación (R) fue de 0.99983, lo que indica una excelente linealidad para el analito.

3.2 Precisión

Fig 2 Cromatogramas superpuestos de la prueba de precisión para el estándar de referencia (20.0 μg/mL)

Tabla 5 Datos de la prueba de precisión para el estándar de referencia (20.0 μg/mL)

Nota: El estándar de referencia de análogo hidroxilado de metionina (a una concentración de 20.0μg/mL) se inyectó continuamente durante 6 réplicas. La repetibilidad (RSD) del tiempo de retención fue del 0.084%, y la del área del pico fue del 0.391%, lo que indica una buena precisión del instrumento.

3.3 Recuperación

Fig 3 Cromatogramas superpuestos de la prueba de recuperación de análogo hidroxilado de metionina en pienso

Tabla 6 Datos de la prueba de recuperación de análogo hidroxilado de metionina en pienso

Nota: La muestra se espicó con el estándar de referencia a una concentración de 40.0μg/mL y se analizó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. La recuperación obtenida fue del 88.56%, lo que indica una buena exactitud del método.

3.4 Límite de detección (LOD)

Fig 4 Cromatograma del estándar de análogo hidroxilado de metionina (2.5μg/mL)

Tabla 7 Datos de la prueba para el estándar de referencia de análogo hidroxilado de metionina (2.5μg/mL)

Nota: Basándose en los datos de prueba del estándar de referencia de análogo hidroxilado de metionina a 2.5 μg/mL como se muestra en la tabla anterior, el límite de detección teórico (LOD) se calculó como 0.033 μg/mL a una relación señal/ruido de 3 (S/N = 3).

3.5 Prueba de una muestra de pienso

Fig 5 Cromatograma de una muestra de pienso

Nota: Se detectó análogo hidroxilado de metionina en una muestra de pienso a una concentración de 0.402μg/mL.

4. Conclusión

Este experimento se llevó a cabo de acuerdo con la norma "Determinación del análogo hidroxilado de metionina en piensos por cromatografía líquida de alta resolución" (GB/T 19371-2025), utilizando el cromatógrafo líquido de alta resolución de la serie Wayeal LC3400 equipado con un detector UV. Los resultados experimentales mostraron que el pico objetivo presentaba buena simetría y un alto número de platos teóricos. En el rango de concentración de 0.5–80.0μg/mL, el coeficiente de correlación (R) fue superior a 0.9998. Los valores de RSD para el tiempo de retención y el área del pico del estándar de referencia de MHA (20.0μg/mL) fueron del 0.084% y 0.391%, respectivamente, lo que indica una excelente precisión del instrumento. La recuperación de MHA en muestras de pienso espicadas a 40.0μg/mL fue del 88.56%, lo que demuestra una buena exactitud del método. El límite de detección teórico (LOD) para MHA se determinó en 0.033μg/mL. El MHA se detectó con éxito en una muestra de pienso a una concentración de 0.402μg/mL. Todos los datos anteriores cumplen los requisitos del método farmacopeico para el rendimiento del instrumento.