Determinación de residuos de eritromicina en residuos de fermentación de antibióticos utilizando el sistema de cromatografía líquida-espectrometría de masas Wayeal LCMS-TQ9200

La eritromicina es un antibiótico macrólido producido por la fermentación de Streptomyces erythreus. Ejerce su efecto antibacteriano principalmente al inhibir la síntesis de proteínas bacterianas. La producción de eritromicina se basa principalmente en la tecnología de biofermentación, que implica pasos como la selección de cepas, el cultivo de semillas, la fermentación a gran escala en tanques, la extracción y la purificación. Después de la fermentación, la eritromicina se extrae con disolventes orgánicos (como el acetato de butilo), seguido de la purificación mediante cristalización o separación con resina de intercambio iónico, lo que finalmente produce sales de grado clínico (por ejemplo, etilsuccinato de eritromicina). Sin embargo, el proceso de producción de eritromicina genera una cantidad significativa de residuos de micelio (residuo de fermentación), que pueden contener antibióticos residuales, proteínas microbianas y subproductos metabólicos. Si no se gestionan adecuadamente, estos residuos pueden entrar en la cadena ecológica a través de la descarga ambiental o el uso como aditivos para piensos, lo que conlleva múltiples riesgos: La eritromicina residual puede promover la propagación de genes de resistencia a los antibióticos en el suelo y las masas de agua, alterando el equilibrio de la comunidad microbiana; amplificada a través de la cadena alimentaria, puede inducir la aparición de cepas bacterianas resistentes en animales o humanos, socavando la eficacia de los antibióticos; además, la materia orgánica no utilizada dentro de los residuos puede causar contaminación ambiental. Por lo tanto, la regulación estricta de los residuos de micelio es una medida crítica para controlar la contaminación de la producción de eritromicina.

Este experimento se llevó a cabo con referencia al estándar "T/PIAC 00003—2021 Estándar de Grupo de la Asociación de la Industria Farmacéutica de China - Método para la determinación de eritromicina en residuos de antibióticos, materiales base de fertilizantes orgánicos, cultivos y medios ambientales", utilizando el sistema de cromatografía líquida-espectrometría de masas Wayeal LCMS-TQ9200 para determinar el contenido de eritromicina en los residuos de micelio. Los resultados experimentales indican que la prueba de idoneidad del sistema demostró una buena forma de pico y una buena linealidad, cumpliendo con los requisitos experimentales.

1. Instrumentos y Reactivos

1.1 Lista de configuración de LCMS

Tabla 1 Lista de configuración de instrumentos

1.2 Reactivos y Estándares

Tabla 2 Lista de reactivos y estándares

1.3 Material experimental y equipo auxiliar

Limpiador ultrasónico

Mezclador Vortex

Centrífuga de alta velocidad

2. Método experimental

2.1 Pretratamiento de la muestra

Pesar 0.5 g de la muestra (con precisión de 0.001 g) en un tubo de ensayo con tapón de vidrio. Añadir 50 ml de acetonitrilo, vortex durante 1 minuto para homogeneizar la mezcla y realizar una extracción asistida por ultrasonidos durante 20 minutos. Luego transferir la mezcla a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos. Recoger una cantidad adecuada del sobrenadante y pasarlo a través de una membrana filtrante de 0.22μm. Descartar al menos 1 ml del filtrado inicial, luego transferir el filtrado restante a un vial LC ámbar para su análisis.

2.2 Condiciones experimentales

2.2.1 Condiciones del método de cromatografía líquida

Columna de cromatografía: C18 1.7μm 2.1x50mm

Fase móvil: A: Acetonitrilo, B: Ácido fórmico al 0.1% en agua

Caudal: 0.3 ml/min

Temperatura de la columna: 30℃

Volumen de inyección: 2μL

2.2.2 Condiciones del método de espectrómetro de masas

Tabla 3 Parámetros de la fuente de iones de espectrometría de masas

3. Resultado del experimento

3.1 Prueba de idoneidad del sistema

Los resultados de la prueba de idoneidad del sistema mostraron picos objetivo bien definidos sin interferencia de picos extraños, cumpliendo con todos los requisitos experimentales.

Fig 1 Cromatograma de la solución de trabajo estándar de eritromicina A (0.5 ng/ml)

3.2 Rango lineal

La curva de calibración para la eritromicina A se preparó diluyendo en serie la solución estándar utilizando soluciones de trabajo de concentración intermedia. La curva demostró una excelente linealidad en el rango de 0.5-500 ng/ml, con un coeficiente de correlación (R²) superior a 0.99.

Tabla 4 Rango lineal de eritromicina A

Fig 2 Curva de calibración para eritromicina A

3.3 Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ)

En este método, el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) para la solución estándar de eritromicina A se determinaron en 0.2 ng/ml y 0.5 ng/ml, respectivamente. Las relaciones señal-ruido (S/N) correspondientes fueron 110.02 y 292.20, superando sustancialmente los requisitos mínimos de 3 y 10, cumpliendo así los criterios de sensibilidad experimental.

Figura 3. Cromatogramas de iones extraídos para el LOD y LOQ de eritromicina A

3.4 Prueba de precisión

La solución de eritromicina A se inyectó consecutivamente siete veces, con los resultados que se muestran en la figura a continuación. La desviación del tiempo de retención para la eritromicina A fue del 0.19%, y la desviación del área del pico fue del 0.96%, ambas por debajo del 5%, cumpliendo con los requisitos experimentales.

Figura 4. Cromatogramas de precisión de la muestra de eritromicina A (7 inyecciones)

3.5 Prueba de muestra

Siguiendo el método de pretratamiento mencionado, el área del pico objetivo en la muestra sólida fue de 7.4E6. Calculado mediante el método del estándar externo, el contenido de eritromicina A en la solución de la muestra se determinó en 400 ng/ml.

Fig 5 Cromatograma de la prueba de muestra de eritromicina A

4. Conclusión

Este método utiliza el sistema de cromatografía líquida-espectrometría de masas Wayeal LCMS-TQ9200 para la determinación del contenido de eritromicina A en residuos de fermentación de antibióticos. Los datos indican que el método demuestra un rendimiento excelente: todos los picos cromatográficos exhiben una forma óptima sin cola, y la sensibilidad cumple con los requisitos experimentales. El coeficiente de correlación lineal (R²) supera 0.99. Las desviaciones del tiempo de retención y del área del pico para todos los compuestos en siete inyecciones consecutivas están dentro del 1%, lo que indica una alta precisión. Los cromatogramas de la muestra no muestran interferencia de picos extraños, y el contenido de la muestra medido es de 400 ng/ml. Este método, equipado con el sistema Wayeal LC-MS/MS, cumple con los requisitos para el análisis cualitativo y cuantitativo de rutina de las muestras de prueba.