Determinación de residuos de antibióticos amfenicoles en carne de pollo por Wayeal LCMS-TQ9200

Palabras clave: LCMS, amfenicol, seguridad alimentaria, residuos de medicamentos veterinarios.

1. Instrumentos y reactivos

1.1 Lista de configuración de LCMS

Tabla 1 Lista de configuración de instrumentos

1.3 Materiales experimentales y equipos auxiliares

Limpiador ultrasónico

Mezclador Vortex

Evaporador de nitrógeno en baño maría

Centrífuga de alta velocidad

2. Métodos experimentales

2.1 Preparación de la solución

2.1.1 Solución de acetato de etilo amoniacal al 2%: Tomar 4 mL de agua amoniacal y diluirla a 200 mL con acetato de etilo.

2.1.2 Solución de cloruro de sodio al 4%: Tomar 4 g de cloruro de sodio, disolverlo en agua y diluirlo a 100 mL.

2.1.3 Solución de n-hexano saturada con cloruro de sodio al 4%: Tomar una cantidad adecuada de solución de cloruro de sodio al 4%, agregar un exceso de n-hexano, mezclar, dejar reposar para la separación de capas y tomar la capa superior de n-hexano.

2.1.4 Solución de trabajo de estándar interno mixto: Tomar una cantidad adecuada de la solución madre de estándar interno mixto, diluir con metanol al 20% para lograr cloranfenicol-D5 a 10 ng/mL y otros estándares internos (florfenicol-D3, tiamphenicol-D3 y florfenicol amina-D3) a 50 ng/mL cada uno.

2.2 Pretratamiento de la muestra

2.2.1 Extracción de la muestra: Pesar 2 g de muestra (con una precisión de ±0,01 g), agregar 100 µL de solución de trabajo de estándar interno mixto, vortex durante 1 min, agregar 10 mL de solución de acetato de etilo amoniacal al 2%, vortex durante 10 min, centrifugar a 8000 rpm durante 5 min y recoger el sobrenadante. Agregar otros 10 mL de solución de acetato de etilo amoniacal al 2% al residuo y repetir el procedimiento de extracción. Combinar los dos sobrenadantes, evaporar hasta sequedad bajo una corriente de nitrógeno a 50 °C y reservar para su uso.

2.2.2 Purificación de la muestra: Agregar 3 mL de solución de cloruro de sodio al 4% al residuo de purificación, vortex para disolver, luego agregar 5 mL de solución de n-hexano saturada con cloruro de sodio al 4%, vortex durante 30 s, centrifugar a 8000 rpm durante 5 min y desechar la capa superior de n-hexano. Repetir el procedimiento de desengrase una vez. Agregar 5 mL de solución de acetato de etilo amoniacal al 2%, vortex durante 10 min, centrifugar a 8000 rpm durante 5 min y recoger el sobrenadante. Agregar otros 5 mL de solución de acetato de etilo amoniacal al 2% al residuo y repetir el procedimiento de extracción. Combinar los sobrenadantes, evaporar hasta sequedad bajo una corriente de nitrógeno a 50 °C, agregar 1 mL de solución de metanol al 20%, vortex durante 30 s, filtrar a través de una membrana y esperar el análisis instrumental.

2.3 Condiciones experimentales

2.3.1 Condiciones de cromatografía líquida

Columna de cromatografía: C18 1,7 μm 2,1x50 mm

Fase móvil: A: Acetonitrilo; B: 2 mM Formiato de amonio en agua

Caudal: 0,3 mL/min

Temperatura de la columna: 40 ℃

Volumen de inyección: 5 µL

2.3.2 Condiciones de espectrometría de masas

Tabla 3 Parámetros de la fuente de iones

3. Resultado del experimento

3.1 Cromatograma estándar

La determinación de cuatro antibióticos amida y sus estándares internos se completó en 6 minutos. Todos los picos mostraron buenas formas de pico sin cola, y cada compuesto demostró una respuesta satisfactoria, cumpliendo con los requisitos experimentales.

Fig 1 Cromatograma de 4 antibióticos amfenicol y estándar interno (cloranfenicol 0,2 ng/mL, otros antibióticos 1 ng/mL)

3.2 Rango lineal

Tomar una cantidad adecuada de la solución estándar mixta de alcohol amida y diluirla gradualmente a una serie de concentraciones para preparar una curva estándar. Se utilizó el método de estándar interno de isótopos para el análisis cuantitativo. El rango lineal fue de 0,2-10 ng/mL para el cloranfenicol y de 1-50 ng/mL para la florfenicol amina, el tiamphenicol y el florfenicol. La desviación entre los resultados de detección lineal y las concentraciones conocidas fue menor que la desviación máxima permitida, con valores de R² que oscilaron entre 0,9958 y 0,9998, lo que indica una excelente linealidad para todos los componentes.

Tabla 4 Rango lineal de compuestos

Fig 2 Datos de la curva de calibración de los cuatro compuestos

3.3 LOD y LOQ

El Estándar Nacional de Seguridad Alimentaria de China GB 31658.20-2022 especifica que para este método, el límite de detección (LOD) para el cloranfenicol es de 0,1 µg/kg y el límite de cuantificación (LOQ) es de 0,2 µg/kg; mientras que para el tiamphenicol, el florfenicol y la florfenicol amina, el LOD es de 0,5 µg/kg y el LOQ es de 1 µg/kg. Las relaciones señal-ruido para todos los compuestos objetivo a las concentraciones especificadas del límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) son significativamente mayores que 3 y 10, lo que cumple con los requisitos de sensibilidad especificados en el estándar nacional.

Tabla 5 Límites de detección y cuantificación para cada compuesto

Fig 3 Cromatogramas de los límites de detección y cuantificación para cuatro compuestos

3.4 Prueba de precisión

Tomar concentraciones bajas, medias y altas de soluciones de mezcla estándar de amfenicol y realizar seis inyecciones consecutivas para comparar las desviaciones en el tiempo de retención y el área del pico. Los resultados se muestran en la tabla a continuación. Las desviaciones del tiempo de retención de todos los compuestos de amfenicol fueron inferiores al 1% y las desviaciones del área del pico fueron inferiores al 5%, cumpliendo con el requisito de precisión de RSD ≤ 15% especificado por el estándar nacional.

Tabla 6 Prueba de precisión para cada compuesto

Fig 4 Cromatogramas de precisión de cuatro compuestos de alcohol amida

3.5 Prueba de recuperación de adición de matriz

La exactitud de este método de detección se evaluó utilizando una prueba de recuperación de adición. Agregar concentraciones conocidas de muestras estándar a la muestra de matriz en blanco en diferentes proporciones para el pretratamiento, preparando muestras con adición de matriz a concentraciones altas, medias y bajas. Cada nivel de concentración de las muestras con adición se analizó de forma independiente seis veces. La tasa de recuperación se calculó comparando la concentración detectada en la matriz antes y después de la adición, evaluando así la exactitud del método. Los resultados se muestran a continuación: en la matriz de pollo, las tasas de recuperación de adición de todos los compuestos oscilaron entre el 94,5% y el 107,2%, con un CV inferior al 5%, lo que indica que la exactitud cumple con los requisitos del método.

Tabla 6 Tasas de recuperación de compuestos en matriz de pollo con adición

3.6 Prueba de muestra

Se extrajeron y purificaron muestras de pechuga de pollo compradas al azar en supermercados utilizando el método de pretratamiento de muestra antes mencionado. Después de analizar las muestras en el instrumento, no se detectó ninguno de los cuatro antibióticos amida.

Fig 5 Cromatograma de cuatro compuestos de alcohol amida en muestras de pechuga de pollo de supermercado

4. Conclusión

Este método utiliza el sistema de espectrometría de masas de cromatografía líquida LCMS-TQ9200 de Wayeal para la determinación de antibióticos amfenicol en alimentos de origen animal, lo que permite la adquisición simultánea de compuestos tanto en modo de iones positivos como negativos. Los datos indican que el método proporciona picos cromatográficos bien formados sin cola, y su sensibilidad cumple con los requisitos del estándar nacional. Los coeficientes de correlación lineal son todos mayores a 0,99. La desviación del tiempo de retención para todos los compuestos en seis inyecciones consecutivas es inferior al 1%, y la desviación del área del pico es inferior al 5%, lo que demuestra una buena precisión. Las tasas de recuperación de adición en la matriz de pollo oscilan entre el 94,5% y el 107,2%, con un CV inferior al 5%, lo que indica que la exactitud cumple con los requisitos metodológicos. Se analizaron muestras de pechuga de pollo compradas al azar en supermercados y no se detectó ninguno de los cuatro antibióticos amfenicol. Esto demuestra que el método, equipado con el sistema de espectrometría de masas de cromatografía líquida de Wayeal, cumple con los requisitos para la detección cualitativa y cuantitativa de rutina de las muestras objetivo.