Determinación de aflatoxina B₁, un carcinógeno del grupo 1, en cultivos oleaginosos mediante el sistema LC-MS/MS Wayeal LCMS-TQ9200

Aflatoxina B₁Es un metabolito secundario altamente tóxico producido principalmente por Aspergillus flavusy Aspergillus parasiticus. Entre la familia de las aflatoxinas, presenta la toxicidad más fuerte y la distribución más amplia. Ejerce sus efectos tóxicos inhibiendo la síntesis intracelular de ADN y ARN e interfiriendo con el metabolismo de las proteínas, con un efecto dañino muy específico en el hígado.En comparación con otras micotoxinas como la ocratoxina y la patulina, la aflatoxina B₁Es extremadamente tóxico y tiene una carcinogenicidad bien establecida. Ha sido clasificado como un Carcinógeno del grupo 1por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Se detecta con frecuencia en cultivos oleaginosos como maní, maíz, nueces y aceites vegetales, lo que lo convierte en un contaminante prioritario para el control de la seguridad alimentaria en todo el mundo.

Contaminación con aflatoxina B₁Generalmente ocurre cuando los cultivos oleaginosos están expuestos a condiciones de alta temperatura y alta humedad durante la siembra, la cosecha o el almacenamiento, lo que promueve el crecimiento de hongos. Además, debido a sus propiedades químicas estables, la aflatoxina B₁Las temperaturas de cocción convencionales no pueden destruirlo, lo que genera problemas recurrentes de residuos en productos agrícolas y alimentos procesados.

La ingestión a corto plazo de una dosis alta puede provocar una intoxicación aguda, que se presenta con síntomas como dolor abdominal intenso, vómitos, ictericia e insuficiencia hepática, que pueden ser mortales en casos graves. La exposición prolongada a dosis bajas provoca acumulación en el hígado, lo que induce daño hepático crónico, como fibrosis hepática y cirrosis, e incluso puede desencadenar cáncer primario de hígado. Las poblaciones con menor inmunidad, incluidos los niños, los ancianos y las personas con enfermedades hepáticas preexistentes, tienen un mayor riesgo de contraer aflatoxina B.₁envenenamiento.

En China, la norma nacional GB 2761-2017 (Norma nacional de seguridad alimentaria – Niveles máximos de micotoxinas en los alimentos) especifica los límites máximos de residuos de aflatoxina B.₁en diversos tipos de alimentos. Además, GB 5009.22-2016 (Norma Nacional de Seguridad Alimentaria – Determinación de Aflatoxinas B y G en Alimentos)proporciona métodos analíticos oficiales para la determinación de aflatoxina B₁.

Esta nota de aplicación describe el establecimiento de un método de cromatografía líquida de dilución isotópica-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la determinación de aflatoxina B.₁utilizando el sistema LC-MS/MS Wayeal LCMS-TQ9200.

Palabras clave:Triple cuadrupolo; Aflatoxina B₁; Cromatografía líquida de dilución isotópica-espectrometría de masas en tándem.

1. Instrumento y reactivos

1.1 Configuración del instrumento

Tabla 1 Lista de configuración del instrumento

1.2 Reactivos y Estándares

Tabla 2 Reactivos y Estándares

1.3 Material de experimentación y equipo auxiliar

mezclador vórtice

Centrífuga de alta velocidad

Balanza analítica

Centrífugo

Colector de extracción en fase sólida (SPE) (con bomba de vacío)

evaporador de nitrógeno

Criba vibradora

2. Método de experimento

2.1 Preparación de la solución

2.1.1 Solución de acetato de amonio de 5 mmol/L:Pesar 0,39 g de acetato de amonio, disolverlo en agua y diluir hasta 1000 ml. Mezclar bien.

2.1.1 Solución de metanol-acetonitrilo:Agregue 100 ml de acetonitrilo a 100 ml de metanol y luego mezcle bien.

2.2 Pretratamiento de la muestra

2.2.1 Extracción de muestras

Pasar la harina de trigo por un colador de prueba de 2 mm de apertura. Pese 5 g de la muestra (con una precisión de 0,01 g) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Sumar 100µL de solución de trabajo de patrón interno isotópico (100 ng/ml), mezclar mediante agitación vorticial y dejar reposar durante 30 min. Agregue 20 ml de solución de metanol y agua (70+30, v/v), agite para mezclar y agite en un agitador orbital durante 20 minutos. Centrifugar a 6000r/min durante 10min. Recoger el sobrenadante para su uso posterior.

2.2.2 Purificación de muestras

Transfiera con precisión 4 ml del sobrenadante a un recipiente, agregue 23 ml de Triton X-100 al 1% en PBS y mezcle bien.

Después de que el líquido original de la columna de inmunoafinidad se haya drenado por completo, transfiera la solución de muestra anterior a una jeringa de 50 ml. Ajuste el caudal para que la solución de muestra pase a través de la columna de manera constante a una velocidad de 1 a 3 ml/min. Después de que la solución de muestra se haya drenado por completo, agregue 2 × 10 ml de agua al cilindro de la jeringa y lave la columna de inmunoafinidad a un flujo constante. Después de que se haya drenado el agua, seque la columna usando una bomba de vacío.

Desconecte el sistema de vacío. Coloque un tubo de ensayo graduado de 10 ml debajo de la columna de inmunoafinidad, retire el cilindro de la jeringa de 50 ml y agregue 2 x 1 ml de metanol para eluir la columna a un caudal controlado de 1 a 3 ml/min. Luego seque la columna nuevamente usando una bomba de vacío. Recoja todo el eluato en el tubo de ensayo.Evaporar suavemente el eluato hasta casi sequedad bajo una corriente de nitrógeno a 50 °C. Agregue 1 ml de la fase móvil inicial, agite durante 30 segundos para disolver el residuo. Filtrar a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y recoger el filtrado en un vial de muestreador automático para su posterior inyección.

2.3 Condición del experimento

2.3.1 Método de cromatografía líquida

Columna: C18, 1.7µmetros, 2,1×50mm

Fase Móvil Fase: A: Solución de metanol-acetonitrilo; Fase B: solución de acetato de amonio de 5 mmol/l

Caudal: 0,3 ml/min

Temperatura de la columna: 40°do

Volumen de inyección: 3 µL

2.3.2 Método de espectrometría de masas

Tabla 3 Parámetros de espectrometría de masas compuesta

Nota: El asterisco (*) indica el ion cuantitativo.

3. Resultado del experimento

3.1 Cromatograma estándar

La determinación de la aflatoxina B.₁y el patrón interno isotópico 13C17-aflatoxina B₁se completó en 5 minutos. Como se ilustra en la Figura 1, ambos analitos mostraron excelentes formas de pico y respuestas satisfactorias, cumpliendo con los requisitos para el análisis experimental.

Fig. 1 Cromatogramas de la aflatoxina B₁y el patrón interno isotópico 13C17​-Aflatoxina B₁

3.2 Rango lineal

Se transfirió con precisión un volumen apropiado de la solución madre estándar y la solución de trabajo estándar interno de isótopos mixtos y se diluyó con la fase móvil inicial para preparar una serie de soluciones estándar de trabajo con aflatoxina B.₁concentraciones de 50, 20, 10, 5, 2, 1 y 0,5 ng/ml. Cada solución contenía el patrón interno isotópico a una concentración de 2 ng/ml. Se construyó una curva de calibración utilizando estos estándares. En el rango lineal de 0,5–50 ng/mL, y después de la corrección usando 13C 17-aflatoxina B₁como estándar interno, las desviaciones entre la aflatoxina B medida y la nominal₁las concentraciones estaban dentro de la desviación máxima permitida. El coeficiente de correlación (R) fue superior a 0,999, lo que indica una linealidad excelente.

Fig. 2 Curva estándar de aflatoxina B₁

3.3 Repetibilidad

Se inyectaron seis veces consecutivas soluciones estándar a tres concentraciones (1, 10 y 20 ng/ml). Los resultados se muestran en la siguiente tabla. Las desviaciones estándar relativas (RSD) de los tiempos de retención y las cantidades de muestra para la aflatoxina B₁en concentraciones bajas, medias y altas estaban dentro del 5%, cumpliendo con los requisitos del experimento.

Cuadro 4 Prueba de repetibilidad para la aflatoxina B₁en concentraciones bajas, medias y altas

3.4 Recuperación de picos

Aflatoxina B₁Se añadió solución estándar a la muestra para lograr una concentración final de 5 ng/ml. Luego, la muestra enriquecida se analizó mediante LC-MS/MS. El resultado medio de seis inyecciones consecutivas fue de 5,147 ng/ml, con una RSD del 1,954 %. La tasa de recuperación calculada fue del 102,94%, lo que cumple con los requisitos del experimento.

3.5 Residuo en blanco

Después de inyectar continuamente la solución estándar de 20 ng/ml, se inyectó posteriormente una muestra en blanco para evaluar el arrastre. Como se muestra en la Figura 3, no se detectó ningún arrastre en la muestra en blanco.

Fig. 3 Cromatograma en blanco del compuesto

3.6 Prueba de muestra

Aflatoxina B₁no se detectó en la Muestra A (Fig. 4).

Fig. 4 Cromatograma de la aflatoxina B₁en la muestra A

4. Conclusión

En este estudio, se utilizó un método de cromatografía líquida de dilución isotópica-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la determinación de aflatoxina B.₁se estableció utilizando el sistema de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida Wayeal LCMS-TQ9200. Los datos obtenidos demuestran que todos los picos cromatográficos exhiben buenas formas de pico sin colas. La sensibilidad cumple con los requisitos experimentales y el coeficiente de correlación (R) es mayor que 0,999, satisfaciendo los criterios de linealidad. La repetibilidad en concentraciones bajas, medias y altas está dentro del 5 % y no se observa ningún arrastre del sistema después de la inyección de muestra de alta concentración. Estos resultados indican que el método, cuando está equipado con el sistema de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem de Wayeal, cumple con los requisitos para el análisis cualitativo y cuantitativo de rutina de las muestras objetivo.