62/2000 Proteger la salud de los lactantes y los niños de corta edad

Prefacio

Los oligosacáridos de la leche humana (HMO) son un grupo de oligosacáridos con un grado de polimerización no superior a 3, presentes naturalmente en la leche humana.constituyen el tercer componente sólido más grande de la leche humanaRegulan la flora intestinal, favoreciendo especialmente la colonización de Bifidobacteriaceae en el intestino del lactante, manteniendo al mismo tiempo la salud intestinal.apoya el desarrollo inmunológico y cerebralDesde que se lanzó la primera fórmula infantil enriquecida con HMO en los Estados Unidos en 2015,una amplia gama de fórmulas infantiles, leche y productos lácteos, suplementos para la salud digestiva y alimentos funcionales que contienen HMOs se han vendido en todo el mundo.2'-fucosilactosa, 3'-fucosillactosa, difucosillactosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-tetraosa, 3'-sialillactosa y 6'-sialillactosa.

Entre los métodos comunes de detección de HMO, la cromatografía líquida requiere una reacción de derivación antes de la detección, implica una preparación de muestras compleja y los reactivos de derivación son a menudo tóxicos;La naturaleza termolabil de los HMO también conduce a una baja respuesta y a una mala repetibilidad en el LC-MS.Por el contrario, la cromatografía iónica con detección amperométrica de carbohidratos ofrece una preparación de muestras sencilla, una alta respuesta y una buena repetibilidad, lo que le da claras ventajas para el análisis HMO.Esta nota de aplicación utiliza hidróxido de sodio preparado manualmente, acetato de sodio y agua ultrapura como eluentes, y utiliza el cromatógrafo iónico WAYEAL IC6300 para determinar HMO en fórmula infantil.alta sensibilidad y buena linealidad, proporcionando una referencia útil para la detección de OMH en los alimentos.

Palabras clave: cromatógrafo iónico; oligosacáridos de la leche humana; detector amperométrico.

1- Instrumentos, equipos y reactivos

1.1 Reactivos y estándares

Cuadro 1. Lista de reactivos y normas

1.2 Materiales de laboratorio y equipos auxiliares

• 1.2.1 Balanza analítica (0,1 mg de legibilidad);
• 1.2.2 Baño de agua termostático;
• 1.2.3 Centrífuga;
• 1.2.4 filtros de membrana de poliétersulfón acuoso (0,45 μm);
• 1.2.5 agua ultrapura;
• 1.2.6 Dispositivo de filtración al vacío;
• 1.2.7 cartuchos de pretratamiento de extracción en fase sólida (SPE) RP;
• 1.2.8 Jeringas desechables (20 ml, 5 ml).

2Método experimental

2.1 Preparación de la solución

• 2.1.1 200 mmol/L de solución de hidróxido de sodio: pipeta de 10,5 ml de 50% de NaOH, diluida con agua hasta 1000 ml y filtrada bajo vacío.
• 2.1.2 Solución mezclada de 75 mmol/l de NaOH y 250 mmol/l de acetato de sodio: se pesan con precisión 20,51 g de acetato de sodio, se disuelven en agua y se transfieren a un matraz volumétrico de 1000 ml; se utiliza con precisión la pipeta 3.95 ml de NaOH al 50%, diluir a 1000 ml con agua ultrapura y filtrar bajo vacío.
• 2.1.3 Solución de ácido sulfosalicílico al 3%: se pesan 3,0 g de ácido sulfosalicílico, se disuelven en agua y se diluyen hasta 100 ml (preparar frescos).
• 2.1.4 Solución de base estándar mezclada: Pesar con precisión 5 mg cada una de 2'-fucosilactosa, 3'-fucosilactosa, 3'-sialillactosa, 6'-sialillactosa, lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa (con la precisión más cercana de 0.1 mg), se coloca en un matraz volumétrico de 10 ml, se disuelve en agua y se diluye hasta la marca para preparar una mezcla de 500 mg/l. Se pesa por separado 1 mg de difucosilactosa (con una exactitud de 0,1 mg),colocar en un frasco volumétrico de 10 ml, se disuelven y se diluyen hasta la marca para preparar una reserva de 100 mg/l.
• 2.1.5 Soluciones de trabajo estándar mixtas: pipetar con precisión la solución de base mixta (2.1.4) en frascos volumétricos y se diluyen con agua para preparar soluciones mixtas de trabajo de 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT y DFL a 0.5, 2, 4, 6, 8 y 10 mg/l. Prepare fresco antes de su uso.

2.2 Preparación de las muestras

Se pesan aproximadamente 2,0 g de muestra en un vaso pequeño, se mezclan cuidadosamente con 50 ml de agua tibia (unos 50 °C), se añaden 40 ml de solución de ácido sulfosalicílico al 3%,transferir y diluir a 100 ml en un matraz volumétrico, y sonicado durante 10 min. Filtrar a través de papel filtro o centrífuga (12.000 r/min, 15 min). Pasar la solución de muestra a través de un cartucho RP SPE y luego un filtro de membrana acuosa de 0,45 μm;desechar los primeros 3 ml y recoger el eluado para su análisisAntes de usar, acondicione el cartucho RP SPE con 20 ml de metanol seguido de 15 ml de agua y equilibre durante 30 minutos.

2.3 Condiciones experimentales

2.3.1 Condiciones de cromatografía iónica

3Resultados

3.1 Alcance lineal

Se analizó una alicuota adecuada de cada solución de trabajo estándar mixta, con un intervalo lineal de 0,5 a 10 mg/l.las desviaciones entre las concentraciones medidas y las concentraciones nominales estuvieron dentro de la desviación máxima admisible, los valores de R2 fueron superiores a 0.999, y todos los componentes mostraron una buena linealidad.

Cuadro 2. Intervalos lineales de los compuestos

Figura 1. Cromatogramas de calibración superpuestos de las siete normas de la OMS

3.2 Resultados de los ensayos de muestras

Las muestras 1 y 2 se ensayaron después de una dilución de 10 veces. El contenido de cada uno de los siete HMO se calculó de la siguiente manera: X es el contenido de la muestra (mg/100 g);c es la concentración en la solución de la muestra a partir de la curva de calibración (mg/L); V es el volumen constante (mL); m es la masa de la muestra (g); f es el factor de dilución.

Figura 2. Cromatograma iónico de la muestra 1 diluida 10 veces

Figura 3. Cromatograma iónico de la muestra 2 diluida 10 veces

Cuadro 3. Resultados de las pruebas de muestra

3.3 Precisión

La solución de trabajo en el cuarto nivel de calibración se analizó en seis inyecciones consecutivas en las condiciones de 2.3.1Los resultados siguientes indican una buena precisión del método.

3.3.1 Precisión de repetibilidad estándar

Resultados de las pruebas:

Figura 4. Cromatogramas superpuestos de inyecciones de réplicas independientes del estándar de calibración S4

Cuadro 4. Precisión de repetibilidad de la norma

3.4 Límites de detección y cuantificación

LOD: las aliquotas de la solución estándar se diluyeron en una solución mixta que contenía 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL y 160 μg/L 3'-SL;Se prepararon y analizaron 20 muestras paralelas.

LOQ: las aliquotas de la solución estándar se diluyeron en una solución mixta que contenía 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL y 500 μg/L 3'-SL;Se prepararon y analizaron seis muestras paralelas.

Los resultados de las pruebas son los siguientes:

Cuadro 5. Resultados S/N para LOD y LOQ de las siete OMS

3.5 Especificidad

Se añadieron aliquotas (100 μL cada una) de soluciones estándar de glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa a un matraz volumétrico de 10 ml y se diluyeron hasta la marca con la solución de la muestra 2 diluida 67 veces.La solución se analizó para comprobar si estos azúcares interfirieron con los picos de los siete HMOComo se muestra a continuación, los cuatro azúcares no mostraron interferencias significativas con la determinación de los siete HMO en la leche en polvo.

Figura 5. Cromatogramas superpuestos de calibración S6, muestreo 2 y muestreo 2 añadidos con los cuatro estándares de azúcar

4Conclusión

En esta validación se utilizó el cromatógrafo iónico WAYEAL para verificar el método de determinación de los OMS en los alimentos.LNnT, LNT, 6'-SL y 3'-SL se eluyen todos en 60 min; la sensibilidad cumple los requisitos de las normas nacionales y los coeficientes de correlación lineal son todos mayores de 0.999. La repetibilidad tanto de los estándares como de las muestras es buena. A excepción de las dos sialillactosas, el LOD y el LOQ se sitúan en el nivel de μg/l. El método tiene una buena especificidad, sin que se encuentren impurezas interferentes,y cumple en general los requisitos normalizados.